冷光源的基本原理

冷光源的基本原理

自然界中有很多种发光过程。发冷光是非高温条件下发光现象的统称。本文描述各种发冷光现象,并详细介绍荧光。描述荧光色素的相关技术术语,如猝灭、漂白或量子产率,在文章第二部分介绍,以便详细了解荧光分子的基本特征。

发光过程

一些非常常见的生物或生化实验方法均基于若干种“荧光素(…escence)”的存在,如发磷光(phosphorescence)、化学发光(chemiluminescence)、生物体发光(bioluminescence)和发荧光(fluorescence)。本文以荧光蛋白为主题,了解更多“荧光素(…escence)”可能大有裨益。这些现象源于拉丁语看见:-escentia,这本身已经暗示与我们的视觉系统具有相关性。所有的“荧光素(…escence)”都表示我们用眼睛可以感知的物理、化学或生物过程。我们在表示变化、活动或过程的单词(如convalescence,康复)后面添加后缀“荧光素(…escence)”。

所以,很显然,荧光是一种我们看得见的、涉及某种变化或某个过程的东西。后面我们再来学习荧光如何满足这些条件。我们首先浏览一下其他的“荧光素(…escence)”,这些都涉及到发冷光。发冷光是非高温条件下发光现象的统称。因此,发冷光可以确定为一种冷体辐射现象。这种辐射可以是化学反应的一部分,也可以是晶体上产生亚原子运动或应力的原因。另一种发光的方式是遇热发光,这里的光由受热物质(如热金属)发出。

化学发光是基于化学反应的发光过程,其中产物具有激发中间体。这种中间体回落到基态时发光。与荧光不同,化学发光材料中的电子由化学反应而不是光子能量吸收激发。化学发光可应用于发光棒等。众所周知的化学发光物质是发光氨,它在刑事侦查中用来发现血迹。这里,血红蛋白中的Fe2+离子将发光氨催化至其发光结构。

如果活生物体发光,不管这种光如何产生,我们都称之为生物体发光。发光的生物体种类众多,如萤火虫(Lampyris noctiluca)或萤火虫(Photinus pyralis)。真菌中有一种非常特别的生物体,名叫奥尔类脐菇(Omphalotus nidiformis),它在黑暗中发光。许多海洋生物,比如珊瑚、海藻、甲壳纲甚至乌贼都发光,它们发出的光大多数为蓝光或绿光。另一种海洋生物是发光水母(Aequorea victoria),绿色荧光蛋白(GFP)的来源。萤火虫等发光只涉及化学发光过程,而A. victoria则涉及化学发光和发荧光过程。科学家发现,水母借助发光蛋白质通过化学反应产生蓝光。然后,这种蓝光在荧光反应中被用来激发前述GFP,从而产生绿光。

图1:荧光雅布伦斯基图

这将我们带到“荧光是什么?”这个问题。发荧光是物质吸收较短波长的光后发光的过程。波长差异称为斯托克斯位移。详细一点说明,如果物质以光子形式吸收光,将产生荧光。这导致电子转移到较高的能级。但是,这种高能量状态非常不稳定,这就是电子往往会返回到基态的原因所在。在此过程中,能量以光子的形式再次释放,并因此发光。与磷光相较,电子能量转移非常快,实际上以纳秒为单位(见图1)。以一个波长激发后发射不同波长的光的任何物质,称为荧光物。这些在下一节中讨论。自然界的大多数荧光物具有宽阔的激发和发射光谱,但对于荧光显微技术,激发和发射最大值明确的物质更有用。

与发荧光类似,发磷光是磷光材料受光激发后发光的现象。尽管它与荧光密切相关,但它的过程要慢得多。相较于荧光,光子的重新发射因激发电子能与“禁止”状态的相关性而减速。因其能量“被捕捉”,它们返回到基态的速度没有荧光那么快。典型的发磷光材料是“在黑暗中发光”的玩具,它们可以用普通灯泡或日光“充电”,便可数分钟甚至数小时发光。

荧光物

如上所述,荧光物是可以发荧光的任何物质。在我们的案例中,荧光蛋白是一种荧光物。详细介绍之前,我们先介绍一些描述荧光蛋白的术语和表达式。使用非常频繁的、与荧光相关的单词是荧光团:荧光团是分子(如蛋白质)中负责发荧光的部分。所以,GFP或其衍生物是任何与GFP或其衍生物结合的混合蛋白(如α-微管蛋白-GFP)的荧光团。但是,荧光团不一定是蛋白质。FITC、TRITC(20个原子)或量子点(100–100,000个原子)等小分子也是荧光团。

图2:荧光蛋白的层次结构

荧光团里面是发色团,这是分子中确定颜色的部分(见图2)。在发色团中,发生电子能级转换和相互关联的光发射(见上文)。至少有两种发色团。它们要么由共轭的π电子共振系统构成(GFP),要么由金属络合物构成(叶绿素、亚铁血红素)。

因其与显微技术具有相关性,我们将进一步了解GFP的发色团。研究发现,GFP发色团的形成除了需要分子氧,无需其他辅助因子或酶组分。受限于GFP氨基酸主链的一级结构,它通过自催化折叠机制自发形成,并通过分子内重排完成。细看可以发现,发色团由三个相关的氨基酸构成。Ser65、Tyr66和Gly67依次经历环化、脱水和氧化。这些反应的结果是生成共轭的π电子共振系统,即成熟的GFP发色团。

观察整个GFP结构,可见环状三肽位于圆柱中间。这个圆柱包含11条链,构成一个β-桶状结构,使蛋白质高度稳定。β-桶状结构直径约为3 nm,高度约4 nm(见图3)。所有迄今为止已知的FP都具有这种保护圆柱,这对它们的光物理性质产生很大影响。GFP的量子产率和光稳定性较高。此外,蛋白结构非常紧凑,耐酸碱效果好。带有GFP标签的样品温度稳定性较高,而且耐多聚甲醛、尿素或盐酸胍等变性物质的能力强。

图3:绿色荧光蛋白(GFP)的分子结构

猝灭和漂白

不过,FP也有一定的局限和限制,这在下一节中提及。比如,猝灭过程使荧光团强度可逆地降低。这种衰变的原因有多种。一方面,可能存在复杂的形成或内部转换。另一方面,猝灭可能是能量转移过程的结果。显微技术应用FRET利用了这个过程。在福斯特共振能量转移或荧光共振能量转移过程中,供体荧光团D的能量转移到受体荧光团A。D的荧光减弱,而A的荧光则增强。

相较于猝灭这种可逆过程,另一种荧光衰减过程,称为漂白,则是不可逆的。长时间暴露于激发光,荧光团遭到破坏,荧光损失将不可逆转。漂白程度取决于光源的强度、暴露时间和能量。漂白之前,每个荧光团都有特定数量的激发和发射周期。GFP的每个分子可以激发约104–105次。这相当于0.1–1秒

使用激光扫描共聚焦显微镜时,大约106 W/m2的光强很常见。这种高能量提供多余的光子,导致大量荧光分子处于激发态中。在这种情况下,它们不再在平常的波长条件下吸收光。这样一来,有效的染料浓度减小,换言之,显示器像素不再是染料浓度的直接函数。与使用简单的弧光灯照明相比较,使用高能量激光时发射和激发之间呈非线性关系。

量子产率

谈到荧光蛋白的效率,我们应提到量子产率。这是荧光团的另一个特征,它比较光子输入和输出。计算特定荧光团的量子产率时,以发射光子量除以吸收光子量:

因此,如果产率为100%,则量子产率为1。激发每使用一个光子,发射将产生一个光子。然而,这只是一种理论值。在实际操作中,激发所使用的光子必须多于发射光产生的光子。比如,GFP的量子产率为0.6(见表1)。换言之,要在发射中获得6个光子,激发时必须使用10个光子。

亮度

应用荧光显微技术时,需要虑及荧光蛋白的另一个重要特征——亮度。这个参数取决于显微镜的质量,是实验成功的关键点。确定荧光蛋白亮度的客观方法是,将其摩尔消光系数乘以其量子产率,再除以1,000。物质的摩尔消光系数告知我们它吸收特定波长光的能力。详细一点,摩尔消光系数是某种物质(以摩尔浓度为单位)在特定波长下距离为1cm处的电磁辐射吸收率大小。因此相应的单位为M–1 cm–1。

通过这样计算,可以比较不同荧光蛋白的亮度。以摩尔消光系数为56,000 M–1cm–1、量子产率为0.6的EGFP为例,获得的值为33.6 M–1cm–1。有时候,人们用到荧光蛋白的相对亮度。在这种情况下,亮度的计算方式为摩尔消光系数乘以量子产率再除以EGFP的亮度值(33.6 M–1cm–1)。这样做,相对亮度被转换为众所周知的EGFP,可更加快速地比较不同的荧光蛋白。

光稳定度

许多荧光显微镜实验涉及到活细胞的观察。考虑到猝灭和漂白等特征时,发现活细胞成像明显高度取决于时间。即便是组织学或固定细胞样品,照射样品的时间不要太长,光强不要太高,这点很重要。描述荧光蛋白抵抗荧光状态衰减机制的参数是光稳定性。光稳定性以截至50%初始亮度消失所消耗的秒数表示。为了比较,以最高值为10 W/cm2的弧光灯提供照明,激光等高强度光源(高达100 W/cm2)可能产生非线性效果。此外,为了测量和比较光稳定性,将荧光蛋白样品的pH标准化为7.0,并调节蛋白溶液微滴大小,使其与一般的哺乳动物细胞等大。连续以上述光源在旁边照明。同时计算光子的发射量。EGFP的一半初始亮度消失耗时174秒(Shaner等 2005)。换言之,发射量从1,000光子/秒降至500光子/秒耗时174秒。

了解特定荧光染料或蛋白质的激发和发射最大值、亮度、量子产率等不同特征,实验人员可以选择不同的候选或观察条件来满足其对特定实验装置的要求。此外,如果他知道不同荧光染料或蛋白的光谱物理特征,他可以详细地解释结果。