微分干涉相衬观察法 (DIC)

微分干涉相衬观察法 (DIC)

利用偏振光观察浮雕样成像

未染色试样通常并不显眼,在明场显微镜检查中几乎看不到试样的细节。但实际上,这些试样会与穿过它们的光源发生作用,并产生相移,而这些现象肉眼是看不见的。染色会导致振幅偏移,且穿过的光线强度会存在差异,但绝大多数情况下,无生命的试样才会发生上述现象。DIC 显微镜检查是一种利用光程长度的梯度差和相移,令相位物体在光学显微镜下清晰可见的技术手段。用户可以利用这种方式,通过适当的相衬度和分辨率来观察活细胞和有机体。

DIC 显微镜产生的图像为浮雕状,看起来有投影。这些图像没有光晕现象,相对其他显微镜而言,由于具备光学切片功能,即使较厚的试样也依然能够成像。

DIC 显微镜检查中,只有偏振光可用于试样照明。上述偏振光通过偏光正交平面,被色散成两条不同的光射线。这两条光射线彼此非常接近。由于这两条光射线在试样中会发生折射或散射,因此,会产生不同的相移。如果这些光射线重新聚合,它们会互相干涉。光线此时为椭圆偏光。该偏光将通过检偏镜转变成振幅移位。通过这种方式,令高达 1/200 波长(使用照相机时,甚至达 1/1000 波长)之间波长差的相位移动,以及整个波长都清晰可见。

图 1:DIC 显微镜示例

光波振荡

在非偏振光中,光波会在光传播轴的各个方向上振荡。但是,在线性偏振光束中,所有光波的振荡均有相同的角度或偏光面。圆形偏光是偏振光的另一种存在形式。光波振荡呈旋转式移动,且绝对值稳定,但是,方向会随着恒角速度的变化而变化。椭圆偏光是线性和圆形偏光的组合。

产生偏振光的设备称为偏光镜。用于确定振荡平面的类似部件被称为检偏镜。偏光镜具有吸附性和光束分裂性的特征。

DIC 显微镜中的光路

DIC 显微镜中,聚光镜前面的偏光镜会发出偏振光。该偏振光将被分成两条线性偏振光射线,通过 DIC 棱镜(亦称作 Wollaston 棱镜)构成偏光垂直面。聚光镜平面上装有 Wollaston 棱镜。 标准的 Wollaston 棱镜由双折射材料制成的两个楔体构成,这两个楔体在其基座上相互贴合,其光轴与外表面平行,且互相垂直。


图 2:在 Wollaston 棱镜前半部分,一条 45° 偏振光被分成两条垂直的偏振光射线,角度分别为 0° 和 90° 。在 Wollaston 棱镜后半部分,将根据偏振光依次改变光分散。两条光射线穿过聚光镜之后,互相平行。

穿过上述棱镜的偏振光被剪切成两条互相接近的光波,具有不同的偏转角,分别为正常波和异常波。它们具有相互垂直的偏光面,针对上述两条光波,中波用于检验其是否存在单独的有效折射率。干涉面会发生波阵面的切变,其位于两个棱镜的折射接合处。光波在空间上由剪切角进行分离。对于穿过整个棱镜的所有匹配光波来说,这些光波的方向和互相之间的距离是相同的。两条光波之间的空间必须小于显微镜分辨率极限。

因此,两个互相接近的光波对将会照亮试样,其与横向位移平行。如果上述两条光波与试样相互作用,而试样每个部分的折射率或厚度各不相同,此时,当光波从试样射出时,其光程长度会存在差异。折射率乘以光路上两点之间的厚度,即算出光程长度。它与传输时间和光速相关。由于光程长度与光的传输时间相关,两条匹配的光波之间会发生相位移。

光波穿过试样之后,穿过另一个 Wollaston 棱镜,然后重新聚集在一起。现在,这些光波将互相干扰,构成椭圆偏光。上述椭圆偏光将穿过检偏镜。仅带有清晰偏光面的光源能够穿过,因此,针对不同光波会产生不同的振幅。相移将转变成振幅移位,会导致生成图像中出现不同的光强度。

现代化 DIC 显微镜中,Wollaston 棱镜常常被更改。Nomarski 棱镜就是一个经过更改的示例。它含有两个双折射光楔,但其中一个楔体与 Wollaston 棱镜相同。另一个楔体则是经过更改的,其光轴被倾斜放置。这会导致干涉面伸出棱镜之外。因此,棱镜可以放在物镜光阑面之外,这样,使用起来比较方便。

DIC 显微镜检查中,相邻物点的相移差有助于成像。用户可以看到折射率或厚度存在梯度差的试样细节。由于光束的偏光彼此垂直,通过旋转显微镜载物台可以获得不同的图像。

记住不要使用DIC 显微镜检查中的塑胶这一点非常重要,因为很多聚合物对光源具有消偏振效应,会妨碍相衬效果


图 4:从光源产生的非偏振光穿过偏振滤光片,并在 45°角度产生偏光。当光线穿过Wollaston 棱镜后,被分离成垂直偏光组分,分别呈 0°和 90°偏光。随后,聚光镜引导光线穿过试样。该试样由两条不同偏光的相干平行光射线照亮。这样,基本上就产生了试样的两个存在稍微位移的明场图像,一个是0°偏光,一个是90°偏光。 由于偏振光不同,这些图像不会互相干扰。由于分离的光射线在穿过试样时,试样的厚度和折射率存在差异,因此这些光射线也会产生不同的光程长度。这样会导致其中一条光射线相较另一条光射线产生相移。穿过物镜后,垂直偏振光将在 135°角度上与一条偏振光重新组合。根据光程长度的差异,两条光射线的干扰会产生变亮、变黑的现象,从而使原本几乎看不见的结构显现出来。最后,未出现任何相移的直接透射光,将在 135°方向上通过偏振滤光片(亦称作“检偏镜”)被清除。