PCR引物设计技巧

PCR引物设计技巧

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。

现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。

同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。

引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
 
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:
 
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
 
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
 
1.  引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
 
2.  避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6 lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
 
3.  长度
寡核苷酸引物长度为15~30 bp,一般为20~27mer。引物的有效长度:Ln=2(G+C)+(A+T+,Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。
 
4.  G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
 
5.  碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
 
6.  引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
 
7.  引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
 
8.  引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。
 
在标准PCR反应体系中,用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A:模板G与引物G:模板A错配对PCR影响是等同的。
 
9.  引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
 
10.  密码子的简并

如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。



多重引物设计技巧

多元 PCR (多重PCR,Multiplex PCR,MPCR) 是指在一个 PCR 反应中使用一个模板和几对引物同时扩增多个目的片段的 PCR 反应。这项技术非常有用,他不仅可以提高 PCR 的产率还能提高 DNA 样品的利用率。

另一种形式的 MPCR 是组合 PCR, 组合 PCR 是在同一 PCR 反应中使用几个不同的模板和几对引物。多元 PCR 和组合 PCR 往往被当作同义词使用。

设计策略

MPCR 要求所有的引物对在同一条件下扩增其各自的特异序列。大多数多元 PCR 反应 局限于扩增 5~10 个目的片段,原因之一是反应中,每另加入一对引物会导致一定程度的灵活性的丢失。引物数量的增加也使引物二聚体和非特异扩增出现的概率增加。因此,进行多元 PCR 要求周密计划,且需多次尝试,使反应条件优化。

理论上,一个多元反应中,所有引物扩增其特异序列的效率应该是一样的,但通常是很难预测一对引物的效率。在相似条件下,退火温度几乎相同的寡核苷酸可更好地工作。

多元 PCR 引物设计和优化的一般规律

当设计 MPCR 引物时,除了引物设计的一般规律外,其他一些因素也必须考虑。一般 来说,一个多元反应中使用的所有引物的 Tm 值应该接近,要避免 3'-核苷酸互补,每一对引物应独立地优化其反应条件。一旦将引物集中,需按顺序混合,然后再进行优化。

1. 引物长度应为 18~24 个碱基,较长的引物更容易形成引物二聚体。

2. 对于 MPCR,退火温度和循环数非常关键。要尽可能提髙退火温度,要确认每一对 引物单独扩增时的退火温度,然后在多元 PCR 反应时采用最低的退火温度。同样,要采用最少的扩增数。

3. 由于多个模板同时扩增,酶量和核苷酸浓度可能成为限制因子,而且完全合成所有 产物所需的时间增加。因此,优化每个反应的试剂浓度和延伸时间就显得非常重要。相对于 单个目的序列的 PCR 而言,多元 PCR 所需延伸时间较长