怎样在线进行PCR引物设计

怎样在线进行PCR引物设计

要先对PCR目的序列的长度有个大致估计:

第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3 Input 0.4.0 (primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是。

 

第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(附件Word文档里有图)在“Paste source sequence below (5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。

 

第三步:重要参数设定。”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是””这个和Primer Size差不多。

 

 

 

 

第四步:Pick primers:点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就 出来了,看看Primer3 Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还要primer本身的信息,包括位置,长 度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),还要产物大小,两引物间任意互补碱 基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。

 

 

 

 

第五步:引物设计检验:可 以仅仅设计一向引物,只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在 Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'->3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可 以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于 RT-PCR所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放 入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,我将抽空 另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到PCR一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。



常见引物设计工具



Oligo 6

作为目前最好、最为专业的引物设计软件,Oligo 的功能很强大,他主要功能有:普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估「引物对」质量的功能。

BLAST

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或 DNA 数据库中进行相似性比较的分析工具。BLAST 程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。

不仅如此,BLAST 还可以衍生出许多其他用途,但都是建立在找到相似性序列(片段)的基础上的。

Beacon Designer 7.0

Beacon Designer 7.0 是 PREMIER 生物软件公司研发的一种实时 PCR 引物和探针设计 软件,可以设计分子信标和 TaqMan 探针,所设计的探针可用于多元和等位基因鉴定实验。

该软件可以用来设计带有适宜长度的茎的信标探针,可以自动调整至理想的二值,检测与 扩增引物间形成的交叉二聚体,因而可防止多元反应之间的竞争。该程序还可推测二级结构和相互杂交,以保证足够强的信号。

发夹结构的 Tm 值采用高精度的 Mfold 运算法则计算。 此外,还可以设计野生型和突变体信标探针,用于研究基因型。该软件在 Windows 和 Macinosh 操作系统中均可使用。

Primer Express 3. 0

Primer Express 3.0 是 Applied Biosystem 研发的基于 NT 的寡核苷酸设计程序,用于支持 Applied Biosystem PCR 和 Sequence Detection System 设备,该软件可以设计标准的 DNAPCR 引物、RT-PCR 引物、嵌套 PCR 引物、等位基因特异引物、多元 PCR 引物和随 TaqMan 探针使用的 DNAPCR 引物。

该软件带有引物检验系统,可以基于:Tm 值、二级结 构和形成引物二聚体的可能性对初步设计的引物进行检验。利用该软件还可以进行引物 注释。

Primer Express 3.0 还可以设计 TaqMan MGB 探针和 TaqMan 探针,可以设计用于单 一序列和多序列(最多可达 48 个)的探针,该程序在 Windows 和 Macinosh 操作系统中均 可使用。

Primer Premier 5

Primer Premier 5 是 PREMIER 生物软件公司整合多重序列比对和引物设计功能而研发 的一套程序,以设计近源种引物。该程序采用了一套具有版权的运算法则推演出一致性较少区域并在目的序列保守性最髙区设计引物。一个基因家族的一致性较少序列的等位基因特异 性引物可以绘图方式设计。

Primer Premiers 提供了一套全面的引物设计方案,可以自动设计也可以手动设计,多 元和嵌套 PCR 引物设计可保证不形成交叉同源序列。检索结果可以保存在内在的数据库中, 且能提供引物的合成顺序形式以方便定购。该软件在 Windows 和 Macinosh 操作系统中均可使用。

Primer Designer-M

Primer Designer-M 可辅助设计测序引物、PCR 引物和寡核苷酸探针。该程序可以阅读 GenBank、EMBL、FASTA 或 Clone Manager 格式文件和 ASC II 纯文本形式的序列数据 文件,而且可以将引物检索信息保存在内在的数据库中,然后用与其成一体的整套最近邻参 数(SantaLiida 1998) 估算引物 Tm 值。

引物设计地址:http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PRIMER_DESIGN/primer_design.html

以下是一些商用的real-time PCR 引物设计软件及其地址

名称 地址
ABI PRISM Primer Express http: //www.lifetechnologies.com/order/catalog/ product/4363993?ICID=search-product
AlignMiner http://www.scbi.uma.es/alignminer/
ConservedPrimers 2.0 http:/ /probes.pw.usda.gov/ConservedPrimers/
EasyExonPrimer http://129.43.22.27/~primer/EasyExonPrimer.html
EcoPrimer http: //www.grenoble .prabi .fr/trac /ecoPrimers
DATFAP http:/ / cgi-www.daimi .au.dk/cgi-chili/datfap/frontdoor.py
DFold http://dfold.cgb.ki.se/
Gemi http: //sourceforge .net/projects /gemi /
GETPrime http://updeplalsrvlxpfl.ch/getprirne/
Java Web Tools http://primerdigital.com/tools/
MultiPriDe (Multiple Primer Design) Available upon request to aziesel@emory.edu
OLIGO 7 http://www.oligo.net/
PerlPrimer http://perlprimer.sourceforge .net/
PRaTo http://prato.daapv.unipd.it/
Primer3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Primer3Plus http://primer3plus.com
Primer3web http: / / primer3 .wi .mit.edu http: //bioinfo .ut_ee/primer3/
PrimerBank http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
Primer-Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.  cgi>LINK_LOC=BlastHomeAd
PrimerCE http://tch.hd3auxdu.cn/sl1engm/download/down.html
PrimerDesign http://www.hiv.lanl.gov/tools/primer/main
PUNS (Primer-UniGene Selectivity) http://okeylabimac.med.utoronto.ca/PUNS
RTPrimerDB http://me dgen. ugen t. be /r tprimerdb/
QPrimerDepot http://primerdepot.nci.nih.gov/ http: //mouseprimerdepot. nci .nih.gov/
QuantPrime http://www.quantprime.de/
RASE http://designs.lgfus.ca/cgi-bin/bsp_designs/index.pl
TOPSI http://www.bhsai.org/downloads/topsi.tar.gz