相差 显示未染色相位物体

相差 显示未染色相位物体

使用成像移

相位物体使穿过样品的光发生相移。因为人眼或光电检测器只能见到振幅偏移(强度差异),样品染色将影响穿过它的光的振幅偏移和强度差异。然而,许多染色试剂对活细胞有毒害作用。相衬[JJ2]显微技术的应用,可借助光程差异造成的相移,在光学显微镜下观察样品。它通过所产生光波的干涉,将相移改为振幅偏移。

相差显微镜技术由荷兰物理学家 Frits Zernike 于二十世纪三十年代发明。该技术在1942年投入使用之后,Zernike在1953年获得诺贝尔物理学奖。

      图1:MDCK细胞,相差显微镜

光波干涉

光程是光径中两点之间折射率和厚度的乘积。它与光的通过时间和速度相关。光波通过样品时,光程差异导致光波速度差异(即相移)。相差由此产生。折射率高于周围介质,导致光波减速和相位延迟。

干涉指的是两个波源彼此相互作用,并遵循叠加原理产生新的波形。光波干涉的相关参数是光波振幅。如果两个波源互相干涉,所产生光波的振幅将等同于两个干涉波的振幅矢量和。

如果所产生的波振幅增大,则干涉具有建设性[JJ3]。如果两个波峰或两个波谷在同一个时间点相遇,将发生这种情形。一个波源的波峰和另一个波源的波谷也有可能在同一个时间点相遇。这导致所产生的波振幅减小。这两个波源之间的干涉称为摧毁性[JJ4]

相差显微镜的光径

相差显微镜的关键元件是环形孔[JJ5]和相位板。环形孔放置在聚光镜的前焦面中,限制穿透光波的角度。相位板位于物镜的后焦面,它的相位环材料可减弱经过它的光,并使其相位改变λ/4。λ表示光的波长。

在相差显微技术中,科勒照明条件下不与样品相互作用的光波在物镜的后焦面聚焦为一个亮环。光圈沿着光轴与相位环空间匹配,导致非偏射光发生相移。因样品而发生衍射的光照射到相位环的部分不多,因此不受影响。

在受影响光波与未受影响光波之间,总相移高达λ/2。非偏射光的相位在相位环上超前λ/4,而衍射光波通常被生物样品拖延λ/4。总相移λ/2使得像平面中光波出现摧毁性干涉。为了减弱穿过相位环的非偏射光,避免非偏射光超过偏射光很重要。

在相差显微镜中观察到相移为λ/2时,产生最大的摧毁性干涉效应,因为波峰和波谷在同一时间点有效相遇。因此,光波振幅减小,相位物体的相移转换为振幅偏移。

图2:相差显微镜的光径。穿过聚光镜环的环状光被聚光镜聚焦在样品上。样品的不易透光结构(如质膜、细胞器等)使部分环状光发生衍射和产生大约¼ λ的相移(生物样品正常现象)。这种发生相移和衍射的光绕过相位环,几乎不受相位环的影响(大部分位于物镜后焦面中)。相较之下,从聚光镜环出来的直射环状光将照到相位环上,后者将减弱直射光,并造成相移(在正相差中通常超前¼ λ或滞后¾ λ)。由于样品折射的光与穿过相位环的光之间的总相移将高达½ λ,因此将出现摧毁性干涉。不易透光结构将因此显得更暗(正相差)。

相位环是相差显微镜的中心组件。它通常由一个灰色滤光片和一个阻滞板构成。穿过样品而未发生衍射的部分光将经过相位环。灰色滤光片减弱光线,以避免照射。阻滞板延迟非衍射光的相位,使其与穿过样品时经历相移和衍射的光波发生干涉。

正与负——两种相差

有两种形式的相差:正相差和负相差。它们的差异主要由用于照明的相位板造成。在正相差中,穿过相位环的光相位相较于偏射光而言为超前状态,而在负相差中则相位滞后。负相差的相位滞后使相位差遭到破坏。光波处于同相状态,出现建设性干涉而不是摧毁性干涉。这使得所产生的光波振幅增大。

在正相差显微技术中,折射率高于周围介质的物体比折射率较低的物体更暗。对于负相差,情况刚好相反。

解释相差图像

相差显微技术可显示样品的光程差异。光程与样品的厚度和折射率相关。质膜和细胞器等细胞结构对光程有很大影响。因为很多细胞(尤其是在细胞培养中)的形状扁平、规则,它们在明视场显微镜中几乎看不见。

这类细胞的相差图像放大细胞结构的差异,可视为一种光学密度图,因为光密度对样品或材料的折射率有很大的影响。然而,若干效应导致相差图像的解释变得复杂,因为它们不直接依赖于光程差异。

光晕效应指的是正相差的大物体出现明亮的边缘,而负相差则出现黑暗边缘。产生光晕的原因是,来自样品的一些衍射光也穿过相位环。非偏移波形成的光环稍微小于相位环,而且来自样品的低空间频率衍射光波可以穿过环面。经过相位环的偏射光保持90°的相位差,因此不受摧毁性干涉的影响。这导致对比度发生逆转,并在大物体边缘形成光晕。

阴影效应(shade-off effect)指的是所显示样品的同质部分与周围介质光强相同的情形。尽管经过这些区域的光产生相移现象,但衍射程度低,而且散射角大为减小。因此,这些光波进入相位环时基本上不偏移,所以不发生干涉。

相差显微技术的另一个问题是对比度反转。如果两个相邻物体中一个折射率大而另一个折射率小,它们将显得更亮而不是更暗(对于正相差)。在这些区域里,生物样品的相移不是常见的λ/4偏移,而且产生的是建设性干涉而不是摧毁性干涉(负相差则相反)。

虽然这些效应会使相差图像的解释变得困难,但相差显微技术使用方便,是用于相位物体成像的重要光学反差技术。此外,相差显微技术可用于活样品中细胞功能和结构的研究,使其成为生物学研究中应用最为频繁的对比方法。

图3:相差显微镜下的细胞